如何改進(jìn)蛋白質(zhì)測定的方法
蛋白質(zhì)是食品中最重要的營養(yǎng)成分，也是評價食品營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)，因而在食品分析中是一個高頻率的分析項(xiàng)目。就分析方法而言，GB/T 5009.5-2003中的第一法是首選的方法。蛋白質(zhì)測定儀法是由樣品消化、水蒸氣蒸餾和滴定三個連續(xù)的操作步驟組成的。鑒于水蒸氣蒸餾耗水費(fèi)電，且高溫操作較不安全，本文改為氣提后，免除了此弊端，分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度完全達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)方法的要求。
1 氣提條件的影響
1.1 空氣流量的選擇在固定氣提時間為 30 min 的條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 2 所示。由圖 2 可見，氣提率隨空氣流量的增大而增加。在流量達(dá) 0.7 L/min 以上時，氣提率已達(dá)100 %。故實(shí)驗(yàn)時選用流量為 0.8 L/min。在此流量條件下為防止吸收液飛濺，在吸收管中放入 3 粒直徑為4~5 mm 玻璃珠，以增大吸收面積并使吸收平穩(wěn)。
圖2 空氣流量對氣提率的影響
1.2 溫度對氣提的影響提高溫度有利于氨的逸出，卻不利于氨的吸收。硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過 40 ℃，否則吸收氨的作用減弱而造成損失。因此，氣提和滴定都選擇在室溫條件下進(jìn)行。由于標(biāo)準(zhǔn)氮溶液的基體與試液基本相同，在相同條件下具有相同的氣提率。因此在分析樣品時，同時分析標(biāo)準(zhǔn)氮溶液來計(jì)算滴定度，則在不同室溫下測定時，由于室溫的不同引起的誤差得以消除。
1.3 堿的加入量的選擇試液中的銨離子必須在強(qiáng)堿性條件才能轉(zhuǎn)變成氨分子而逸出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NaOH （400 g/L）溶液加入量在9~13 mL，氣提率均能達(dá)到 100 %，因此選用加入量為 10 mL。
1.4 氣提時間的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3 所示，由圖 3 可見，氣提時間在25 min 以上時，氣提率均能達(dá)到 100%。因此試樣和氮標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析均選用氣提時間為 30 min。一臺大樣采樣器可同時分析兩個樣品，效率提高了一倍。同時，氣提和滴定操作交叉進(jìn)行，又利于工作安排。
圖3 氣提時間對氣提率的影響
1.5 吸收液體積的影響在固定硼酸量為 0.2 g 時，加入不同量的水來配制吸收液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：吸收液的體積變化在 15~25mL 之間，對測定結(jié)果無影響。故實(shí)驗(yàn)選用硼酸（10g/L）溶液的加入量為 20 mL。
1.6 干擾及其消除若實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的空氣中含有氨或有啟用氨水之操作及有可能存在的堿性氣體，均對測定有正干擾，但可用裝有硼酸棉的凈化管來消除；空氣中的酸性氣體如二氧化硫、氮氧化物、二氧化碳等，可被試液中的游離堿吸收，不干擾測定。食品中如含硝酸鹽或亞硝酸鹽或亞硫酸鹽，在試樣處理時，能揮發(fā)除去，故對測定無影響。若食品中混有或人為加入的含氮有機(jī)化合物如三聚氰胺、尿素、氨基化合物等等，均有嚴(yán)重的正干擾，必須在試樣處理前檢測后進(jìn)行分離。
從試樣的消化處理看出，本法測得的是總氮量，包括蛋白質(zhì)、核酸、生物堿、卟啉、含氮類脂及色素等。它是通過合適的系數(shù) F 來換算成蛋白質(zhì)含量的。
食品種類不同，換算系數(shù)也各異。
2 滴定條件的選擇
2.1 滴定指示劑的選擇和配制在酸堿滴定中，選擇指示劑變色的 pH 距間是否與滴定反應(yīng)的等當(dāng)點(diǎn)基本相符及其在滴定終點(diǎn)時色變的敏銳程度都是十分重要的。本實(shí)驗(yàn)用硫酸來滴定氨，滴定的 pH 突躍大致在6.3~4.3 之間。選用的甲基紅與溴甲酚綠混合指示劑的變色點(diǎn)為 pH 5.1，在滴定的pH 突躍范圍之內(nèi)，也與滴定反應(yīng)的等當(dāng)點(diǎn)相符。指示劑變色的敏銳程度則與兩個指示劑的配比有關(guān)。我們選用了國內(nèi)和國際上公認(rèn)的配比，即 3 份 0.1%溴甲酚綠乙醇溶液與 1 份0.2%甲基紅乙醇溶液混合。
我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，該混合指示劑在滴定終點(diǎn)時色變非常敏銳，是一個理想的指示劑。在 20 mL 吸收液中的加入量以 2~3 滴為宜。又為簡化操作，將指示劑合并加入硼酸吸收液中。
2.2 滴定劑的濃度和選擇鑒于上述混合指示劑的敏銳性，作為滴定劑的硫酸（1/2 H2SO4）溶液的濃度由 0.05 mol/L 降至0.025mol/L，滴定終點(diǎn)指示劑的色變?nèi)允智逦９试跇悠泛扛邥r，可選用前者；而在含氮量低時，則選用后者，以減小滴定誤差，提高分析的準(zhǔn)確度。
2.3 基準(zhǔn)物質(zhì)的選擇如果我國質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測的主管部門制備有食品標(biāo)樣發(fā)售，那么就可用這個標(biāo)樣作為基準(zhǔn)物質(zhì)，在與試樣相同條件下消化、氣提和滴定，就可根據(jù)標(biāo)樣含蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值來計(jì)算試樣的蛋白質(zhì)含量，這無疑是一個最好的方法。在無食品標(biāo)樣的情況下，考慮到試樣在消解過程中，蛋白質(zhì)中氮素全部轉(zhuǎn)化為硫酸銨。
因此，我們選用優(yōu)級純的化學(xué)試劑硫酸銨作為基準(zhǔn)物質(zhì)來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。若硫酸銨難以購得，用優(yōu)級純氯化銨也是可行的。只是前者相對分子質(zhì)量較大，配制時可減小稱量誤差。
2.4 空白實(shí)驗(yàn)液的滴定按文獻(xiàn)的要求，每次樣品的分析都需作試劑空白實(shí)驗(yàn)。這是一件麻煩的事�？瞻椎味ㄖ档膩碓�，來自實(shí)驗(yàn)中加入的各種試劑和實(shí)驗(yàn)用水。如果實(shí)驗(yàn)使用無氨水（其制備方法見文獻(xiàn)）則實(shí)驗(yàn)空白僅與試劑有關(guān)。故我們在配制氮標(biāo)準(zhǔn)溶液時，加入與試樣處理同量的試劑，則試劑空白的影響得以消除。
3 方法的準(zhǔn)確度和精密度考查各類食品用GB/T5009.5-2003國家標(biāo)準(zhǔn)方法和本法多次重復(fù)測定的結(jié)果列于表 1。由表 1 看出，樣品分析的相對誤差在 0.78%以下，本法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也在 0.75%以內(nèi)，完全能達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)方法對準(zhǔn)確度和精密度的要求。
表1 樣品分析結(jié)果
4 結(jié)論本文研究成功的食品中蛋白質(zhì)測定的新方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，它具有節(jié)能、降耗、增效、安全、準(zhǔn)確等五大優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)于國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T5009.5-2003 的分析方法。值得推廣和應(yīng)用。
